《表1 寡核苷酸链的合成：应用CRISPR/Cas9系统构建敲除APE1基因的AC16心肌细胞株》

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《应用CRISPR/Cas9系统构建敲除APE1基因的AC16心肌细胞株》

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首先，在http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/网站确定人类APE1（NC＿000014.9）的基因序列。接着，针对APE1基因序列的sgRNA设计，依据CRISPR/Cas9靶点设计原则：(1）sgRNA的5′端第一个碱基如果不是G，则需要在前面加1个G；（2）以sgRNA序列为模板，设计其互补链；（3）sgRNA与其互补链分别添加BbsⅠ的酶切位点。采用哈佛大学张峰实验室提供的在线设计程序（http：//crispr.mit.edu/），设计人APE1的向导RNA（sgRNA），具体过程如下：(1）从APE1基因外显子寻找富含NGG并位于同一外显子上的序列，提交到网络；（2）依据提交后网站的结果，选择分数比较高的2条序列，所生成的靶序列都是5′→3′；（3）分别在正义链模板和反义链模板的5′端添加CACC和AAAC，能与BbsⅠ酶切后形成的黏性末端互补（表1）；同时根据靶位点设计CRISPR/Cas9敲除鉴定引物Forward 5′GTTTGTCATTCCCTTGATGTAC 3′，Reverse 5′GACATTTAGGAAATACAACTGG 3′。