《表2 靶序列扩增引物：利用CRISPR/Cas9系统对人A549肺癌细胞NRF2基因的稳定敲除及其功能研究》

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《利用CRISPR/Cas9系统对人A549肺癌细胞NRF2基因的稳定敲除及其功能研究》

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病毒包装是我们实验室比较成熟的一项技术。根据pLenti CRISPR v2-NRF2 sgRNA-F/R质粒与慢病毒包装载体PSPAX2，PMD2.G之间的摩尔质量比，计算出各自需要的量，实现pLenti CRISPR v2-NRF2 sgRNA-F/R质粒的共同转染至HEK-293T细胞，6 h后换成含血清的高糖DMEM培液，48 h后收集病毒上清液，与polybreen（聚凝胺，转染增强剂）（8μg/mL）比例充分混合后加入A549细胞培养板中，72 h后弃去培液，加入含Blasticidins（20μg/mL）的F-12K培养基，筛选7 d后，将剩余存活细胞铺至96孔板，保证每孔1个细胞，数天后开始挑取单克隆细胞，提取细胞DNA。然后在靶序列两端设计引物（表2），RTFQ-PCR扩增产物送铂尚生物技术（上海）有限公司测序。