《表1 引物及其序列：CRISPR/Cas9介导的荔枝霜疫霉基因组编辑系统的建立》

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《CRISPR/Cas9介导的荔枝霜疫霉基因组编辑系统的建立》

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对于pYF2.2-GFP-Ribo-sgRNA载体的重新构建，首先通过网站EuPaGDT（http:∥grna.ctegd.uga.edu/）设计出PlAvh133基因的sgRNA靶向序列共20 bp，随后利用网站RNA structure（http:∥rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb/Servers/Predict1/Predict1.html）检测其RNA的二级结构。选择合适的sgRNA靶向序列后，根据Fang等[12]的方法，将20 bp序列加上载体上的序列共两条反向互补的68 bp寡聚核苷酸送公司（上海生工）合成（表1），返回后将其稀释到100μmol/L，配成如下退火体系:3μL Sense oligo，3μL Anti-sense oligo，3μL 10×PCR buffer，4μL NaCl，19μL ddH2O。沸水浴2 min，室温放置冷却。最后将退火产物与经NheⅠ和BsaⅠ酶切的pYF2.2-GFP-Ribo-sgRNA进行连接转化。