《表2 本研究所用引物：一个CRISPR/Cas9-VQR基因编辑系统的构建》

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《一个CRISPR/Cas9-VQR基因编辑系统的构建》

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利用Cas9/VQR-gRNA靶点效率检测试剂盒（北京唯尚立德生物科技有限公司）检测4个gRNA对靶位点的切割效率。首先，参考试剂盒分别合成gRNA1、gRNA2、gRNA3和gRNA4引物（表2）；然后以标准gRNA模板为模板，分别通过PCR扩增gRNA1、gRNA2、gRNA3和gRNA4及试剂盒提供的标准g RNA（S1和S2），回收纯化PCR产物作为DNA模板分别进行体外转录，回收并定量转录g RNA；其次，通过搭桥PCR的方式，将gRNA靶位点（包括PAM序列）构建到PCR产物中，获得用于酶切的DNA；最后，参照试剂盒提供的Cas9/VQR酶切体系，加入2μL 10×Cas9 buffer、1μL Cas9/VQR酶、50 ng体外转录的gRNA、50 ng酶切的DNA、补DEPC H2O至20μL，充分混合后，37℃反应30 min，然后加入3μL DNA Loading buffer，混合后65℃5min，2%琼脂糖凝胶电泳检测分析酶切结果。此外，每次酶切实验的同时做标准靶位点的gRNA酶切实验，以标准靶位点酶切实验结果作为阳性对照比较活性。通过与2个阳性参照标准S1和S2估算gRNA的活性。根据SSA活性，标准S1=3，标准S2=10，通过酶切条带的灰度与标准S1和标准S2对比，换算出gRNA1（g1）、gRNA2（g2）、gRNA3（g3）、gRNA4（g4）的活性（若检测gRNA酶切条带的灰度小于标准S1的灰度，则活性估值小于3；若检测gRNA酶切条带的灰度大于标准S1的灰度，且小于标准S2的灰度则活性估值大于3小于10；若检测gRNA酶切条带的灰度大于标准S2的灰度，则活性估值大于10）。