《表1 本研究所用引物：一种有效的嗜热真菌杜邦嗜热菌靶向基因替代系统》

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《一种有效的嗜热真菌杜邦嗜热菌靶向基因替代系统》

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利用AntiSMASH对杜邦嗜热菌基因组进行生物信息学分析，根据预测分析的次生代谢产物生物合成基因簇，本研究选择了其中一个聚酮合成酶基因（polyketide synthase，PKS）Talth1＿006479＿t1（以下简称KS30）作为目标基因。通过保守域分析，预测KS30为PKS基因，包含3个真菌聚酮合酶的基本结构域:酮基合成酶（ketoacyl synthase，KS）、酰基转移酶（acyltransferase，AT）、酰基载体蛋白（acyl carrier protein，ACP）。通过BLAST比对，发现KS30蛋白与Aspergillus udagawae中的conidial yellow pigment biosynthesis polyketide synthase相似度达59%，推测其具有参与真菌色素合成的功能。本研究选择KS30作为目标基因，并对其中的关键结构域酮基合成酶（KS）进行敲除，以通过表型变化分析敲除结果及验证基因功能。敲除载体的构建先以质粒pAg1-H3为模板克隆潮霉素B抗性基因（Hygromycin B），然后以杜邦嗜热菌T.dupontii NRRL 2155基因组模板克隆目标基因KS30的上下游同源臂，分别利用SbfⅠ、XhoⅠ对质粒pPK2.SUR.eGFP进行双酶切，通过In-fusion技术将上游同源臂-潮霉素抗性基因-下游同源臂连接到质粒pPK2.SUR.eGFP上，经过PCR验证及测序比对正确的质粒即为敲除载体pPK2KOKS30。所用引物名称和序列见表1。