《表1 引物序列：细胞周期因子Geminin对CRISPR/Cas9编辑效率的影响》

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《细胞周期因子Geminin对CRISPR/Cas9编辑效率的影响》

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*下划线标注的是sg RNA序列，斜体标记的核苷酸序列是BbsⅠ酶切后的粘性末端连接位点。

将HEK293T细胞种在12孔板中，在细胞融合度达到60～70%时同时瞬时转染等量的wtCas9和Geminin-Cas9质粒（具体操作按Lipo3000转染试剂说明书），转染24 h后将培养基换成带有2.5μg/m L嘌呤霉素的培养基，筛选48 h后将细胞传代除去死去的细胞。在传代后的不同时间分别收集细胞样品，用细胞基因组提取试剂盒提取细胞基因组后，将提取的基因组作为模板，用测定引物COSMC-PCR-Forward和COSMC-PCR-Reverse（表1）通过基因组PCR得到包含靶序列的一段COSMC基因片段，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物条带及其亮度后将PCR产物送到上海擎科测序公司进行测序鉴定。最后利用TIDE网站（https://tide.deskgen.com/）放入测序结果文件计算出Cas9对细胞中COSMC基因的编辑效率。每个样本包括3复孔，每个实验重复2次。具体实验过程示意图如图1所示。