《表3 线性试验结果：利用CRISPR/Cas9系统构建HMGA2敲除肝癌细胞株及其功能鉴定》

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《利用CRISPR/Cas9系统构建HMGA2敲除肝癌细胞株及其功能鉴定》

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注:下划线为sgRNA位点。

将两对PX458-sgRNA载体混合转染Hep G2细胞，采用有限稀释法获得单克隆细胞集落，用一对鉴定引物，采用短片段扩增程序进行PCR鉴定，敲除株由于大片段删除可以得到400 bp左右的片段（图3A）。将扩增片段测序，结果显示在sgRNA位点处存在套峰，即插入/缺失突变（图3B）。进一步基因型分析显示，敲除株的基因组存在大片段缺失（表3）。对敲除株细胞进行RT-q PCR检测，结果表明在mRNA水平上HMGA2的表达已有大幅度下降（P<0.01，图3C）。Western blot检测显示已经完全没有HMGA2蛋白的表达（图3D）。综合结果可知，获得的细胞株为HMGA2-/-细胞株。