《表1 sg RNA序列:利用CRISPR/Cas9 AAV系统构建纹状体Slc20a2基因敲除小鼠模型》

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《利用CRISPR/Cas9 AAV系统构建纹状体Slc20a2基因敲除小鼠模型》


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合成sgRNA时需在序列里添加5-cacc-3和5-aaac-3,以与Bbs I酶切位点的粘性末端互补。

根据CRISPR/Cas9系统sg RNA设计原则,使用Zhang lab网站(http://crispr.mit.edu)对鼠源Slc20a2基因(Gene ID:20516)第3外显子(290~429 bp)设计靶点,选择敲除效率分数最高的3个sg RNA(sg RNA1、sg RNA2、sg RNA3),具体信息见表1。sg RNA序列若不以G碱基开头,可添加1个G碱基以便U6启动子转录。在合成sg RNA时需在序列里添加5?-cacc-3?和5?-aaac-3?(表1),使其退火后形成可与Bbs I酶切位点互补的粘性末端。根据靶位点设计扩增引物,分别为E3F:5?-TGACTCATCATTGG-CACAGG-3?和E3R:5?-TAAGGCTCTTCTTCACGT-GG-3?,扩增长度为650 bp。sg RNA1、sg RNA2和sg RNA3切割后产物大小分别约为297 bp和353 bp、288 bp和362 bp、248 bp和402 bp。