《表1 DoSCL3基因克隆及qRT-PCR引物》

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《铁皮石斛GRAS转录因子家族基因SCL3克隆及表达分析》

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通过前期转录组数据分析发现一条1 278 bp的CDS序列被注释为SCL3，将此序列通过NCBI的Blastx和ORF Finder分析，发现其具有完整的开放阅读框（open readingframe，ORF）和5'UTR，但3'UTR不完整。根据参考序列设计1条用于3'-RACE反应的基因特异引物SCL3-GSP-F（表1）。3'-RACE PCR反应可参照试剂盒SMARTer誖RACE 5'/3'Kit（Clontech，日本）说明书进行，以铁皮石斛种子总RNA（1μg）为模板，合成3'-RACE Ready cDNA，25μL PCR体系包括2×SeqAmpTMPCR Buffer 12.5μL，SeqAmpTMDNA Polymerase 0.5μL，3'-RACE ready-cDNA 1.25μL，SCL3-GSP-F（10μmol/L）0.5μL，10×UPM 2.5μL，dd H2O 7.75μL。琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物后，对目的条带进行回收、纯化、克隆并测序，测序结果结合原序列设计ORF引物SCL3-ORF-F/R以及5'UTR引物SCL3-5'UTR-F/R（表1）。以铁皮石斛原球茎cDNA为模板，用试剂盒Phanta誖Max Super-Fidelity DNA PolymeraseEx TaqTM（Vazyme，中国）进行RT-PCR扩增反应，反应体系为25μL:2×PhantaMaxBuffer12.5μL，模板cDNA1μL，d NTPMix0.5μL（10mmol/L），Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 0.5μL，正/反向引物各0.5μL，ddH2O 9.5μL。PCR反应程序参考已发表文献（刘思思等，2016）。