《表1 基因克隆及qRT-PCR引物序列》

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《苹果脂氧合酶基因MdLOX1a的同源克隆与功能验证》

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于NCBI(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov）查找Md LOX1a基因序列及起始密码子上游的启动子序列，编码该蛋白的基因序列号为LOC103411221，设计基因上下游引物F(5′-ATGTTGCACAACCTGCTTG-3′）和R(5′-TTAGATAGAGACGCTGTTGGGA-3′）（表1），以c DNA为模板利用RT-PCR(RT-PCR，reverse transcription-PCR）技术克隆编码区全长。设计启动子上下游引物F(5′-TCGGGAGGAAAAATCGGGT-3′）和R(5′-TGTGTTCTAGTTTCCAAGAACTAATTAAGC-3′）（表1），以DNA为模板利用RT-PCR技术扩增。具体反应体系：14.5μL ddH2O、5μL 5×HF Buffer、2.5μL 10 mmol/L dNTP、1μL模板、上下游引物各1μL、0.5μL酶。MdLOX1a的RT-PCR克隆程序为：98℃30 s；98℃10 s，58.5℃30 s，72℃120 s，35个循环；72℃10 min。MdLOX1a启动子的扩增程序同上，仅第2阶段孵育30 s时温度设为60℃。扩增产物经电泳回收目的条带，连接pLB(VT205）载体送测序。通过Expasy网站对MdLOX1a蛋白进行理化性质分析，用NCBI网站进行MdLOX1a基因组结构的构建，使用MEGA 5.1软件构建系统进化树，并用PlantCARE(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/htmL/）数据库对MdLOX1a部分启动子的顺式作用元件进行预测。