《表1 各内参基因荧光引物扩增信息》

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《龟裂链霉菌M527荧光定量PCR内参基因的选择及其稳定性评估》

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从NCBI网站下载各内参基因序列信息，在龟裂链霉菌M527基因组中比对得到相应的内参基因序列，命名为16S rRNAsr、hrdBsr、rpoAsr、sigFsr、sigBsr、gyrBsr。根据比对到的内参基因序列，使用Primer Premier 6.0设计荧光引物，如表1。引物需制作标准曲线验证引物的特异性以及扩增效率，使用cDNA为模板，以1:5的比例将模板稀释成5个梯度进行试验。采用TB Green?Premix Ex TaqTM II（TliRNaseH Plus）试剂盒进行RT-qPCR试验，每个样品3次重复，反应体系为20μL:TB Green Premix Ex Taq II(TliRNaseH Plus）（2×）10μL，PCR Forward Primer(10μM）0.8μL，PCR Reverse Primer（10μmol/L）0.8μL，ROX Reference Dye II（50×）0.4μL，c DNA模板2μL，灭菌水6μL；反应条件为：94℃30 s；94℃5 s，60℃31 s，40个循环；95℃15 s，60℃60 s，95℃15 s。试验使用Applied Biosystems StepOnePlus Real-Time PCR System(Life Technologies）仪器。要求所设计引物的熔解曲线峰型单一、所作标准曲线R2>0.98、扩增效率（Efficiency）90%～110%，方可用于后续试验。