《表1 构建sgRNA表达载体引物、基因组扩增引物及荧光定量PCR引物信息》

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《CRISPR/Cas9系统介导的miR-155基因敲除细胞的制备》

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利用sgRNAcas9软件在ssc-miR-155前体区域设计4条特异性的sgRNA引物，引物名称分别为sgRNA39F/R、sgRNA42F/R、sgRNA51F/R、sgRNA52F/R（表1），以pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin(Addgene:#51133，简写pGL3-U6-sgRNA）载体为骨架构建表达载体。提取包含4条sgRNA靶位点及ssc-miR-155前体序列在内的696 bp基因组序列，用Premier5.0软件设计最佳的PCR扩增引物对ssc-miR-155F/R（表1），引物合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。sgRNA表达载体构建步骤为：取浓度为10μmol/L的前向与反向引物各5μL在PCR仪上用95℃，10 min；65℃，1 h；pGL3-U6-gRNA质粒用Bsa I酶（NEB北京）进行酶切，酶切回收备用，连接退火后的sgRNA；将退火后的sgRNA稀释100倍，取1μL与酶切的pGL3-U6-gRNA质粒，使用T4DNA连接酶（宝生物工程（大连）有限公司）16℃连接1 h；取2μL连接产物，转化到DH5α感受态细胞（宝生物工程（大连）有限公司）中，涂布到加了氨苄的LB固体培养基上，挑选用PCR扩增（此时用U6左引物和sgRNA右引物鉴定阳性克隆）鉴定成功的单克隆菌液，送生工生物工程（上海）股份有限公司用“U6seqF”引物测序鉴定，将靶向ssc-miR-155前体的不同位置sgRNA表达载体分别命名为：sgRNA51、sgRNA52、sgRNA42和sgRNA39。测序正确的阳性菌扩大培养，用无内毒素质粒提取试剂盒（Endo-free Plasmid DNA Mini KitⅡ，Omega Bio-Tek）抽提表达质粒，测定浓度后备用。