《表1 本研究所用的引物：敲除TMS5基因获得温敏不育粳稻新材料》

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《敲除TMS5基因获得温敏不育粳稻新材料》

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根据刘耀光实验室的方法[28]，在靶点序列正义链和反义链的5′端分别添加BsaⅠ酶切位点GGCA和AAAC，使其与pUC18骨架经2个BsaⅠ切割后形成黏性末端。将靶点接头引物TMS5-U3-F/TMS5-U3-R混合均匀（终浓度1μmol/L），95℃下变性3 min后退火形成二聚体。配制10μL BsaⅠ-连接反应液（1μL引物二聚体，1μL p YL-U3-gRNA载体，0.5μL BsaⅠ，1μL T4 DNA连接酶缓冲液，0.2μL T4 DNA连接酶和6.3μL dd H2O），通过边切边连的方法将接头连接到p YL-U3-gRNA上。通过两轮巢式PCR，扩增含有TMS5-1的g DNA表达盒U3-TMS5-1-gRNA（第一轮PCR扩增使用通用引物U-F/U-R，第二轮PCR扩增使用特异性引物Uctcg-B1′/g Rcggt-BL）。最后，将扩增出的靶标g DNA盒通过BsaⅠ和T4 DNA连接酶组装到pYLCRISPR/Cas9-MH载体上（酶切连接同时进行），并转化大肠杆菌DH5α。引物SP1/SP2用于检测生长出的克隆中是否含有sgRNA表达盒连接片段。挑选含有目的条带的克隆进行测序分析。具体引物序列见表1。所有引物均由南京擎科生物技术有限公司合成。