《表2 Cre/lox P系统基因敲除所用的引物》

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《谷氨酸棒状杆菌CRISPR-Cpf1和Cre/loxP基因敲除技术的比较》

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注:下划线表示限制性酶切位点.Note:The underlined sequences are the restriction enzymes sites.

以敲除谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032基因组的argR为例，Cre/loxP系统敲除质粒的构建步骤如下。首先以谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032基因组为模板，分别以argR-U-F/argR-U-R和argR-D-F/argR-D-R为引物扩增得到argR的上、下游同源片段，其中在上游同源片段的5′末端和下游同源片段的3′末端分别引入Hind III和Bam H I酶切位点序列。然后以pDTW202质粒为模板，以argR-K-F/argR-K-R为引物，扩增两端含有loxP位点的kanR片段。通过融合PCR使上述3个片段串联融合，同时pBlueScript II SK经过Hind III/Bam H I酶切后即可获得线性化片段，然后利用Gibson法将融合片段与线性化载体进行连接，并取5μL连接液通过化学转化法转化至E.coli JM109感受态细胞，待其长出菌落后进行菌落PCR和基因测序验证，其中验证正确的打靶质粒命名为pDTW203，具体流程如图1所示。其中引物设计见表2。