《表1 基因敲除引物：铜绿假单胞菌waaL突变体构建及糖基化系统的建立》

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《铜绿假单胞菌waaL突变体构建及糖基化系统的建立》

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用同源双交换法敲除PAO1株的waa L基因，流程如图1。根据PAO1株waa L基因及上下游序列，设计构建打靶片段所需引物（表1）。以PAO1株为模板，用引物waa L-5F/waa L-5R扩增上游同源臂，用引物waa L-3F/waa L-3R扩增下游同源臂；以p JQ200SK质粒为模板，用引物Gm-F/Gm-R扩增庆大霉素抗性基因（Gm）；之后将waa L基因上游同源臂、Gm抗性基因、waa L基因下游同源臂通过融合PCR技术连接，得到完整打靶片段Δwaa L::Gm（上游同源臂-Gm抗性基因-下游同源臂），再将其与SmaⅠ酶切的自杀质粒p CVD442相连，获得打靶质粒p CVD442-Δwaa L::Gm。将p CVD442-Δwaa L::Gm电转化具有性菌毛的大肠杆菌β2155，获得供体菌β2155/p CVD442-Δwaa L::Gm，并将供体菌与Pa受体菌接合，在Gm平板（含Gm 50μg/m L）上筛选获得Gm抗性的Pa克隆（基因组整合有打靶质粒），命名为PAO1/p CVD442-Δwaa L::Gm。以基因组上waa L上下游同源臂以外的一对引物waa L-out F/waa L-out R及Gm内部引物Gm-seq F/Gm-seq R组合成5'端交叉引物（waa L-out F/Gm-seq R）和3'端交叉引物（Gm-seq F/waa L-out R）进行此次重组的验证。取数个验证成功的PAO1/p CVD442-Δwaa L::Gm克隆菌液涂布于含10%蔗糖（含Gm 50μg/m L，不含Na Cl）的LB平板上，培养至生长出单克隆，利用Sac B基因内部引物Sac B-F/Sac B-R、waa L基因内部引物waa L-F/waa L-R和外部引物waa L-out F/waa L-out R筛选waa L基因被Gm抗性基因插入打断的克隆，命名为PAO1Δwaa L。