《表3 CRISPR-Cpf1系统基因敲除所用的引物》

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《谷氨酸棒状杆菌CRISPR-Cpf1和Cre/loxP基因敲除技术的比较》

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以敲除谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032基因组的argR为例，CRISPR-Cpf1系统敲除质粒的构建步骤如下。首先以pJYS3＿ΔcrtYf质粒为模板，以crtYf-F-1/crtYf-R-1为引物进行定点突变，通过全质粒PCR将crtYf基因的crRNA序列（5′-GAATTTCT ACTGTTGTAGATCAGGCAACCATAGGGCAGGA A-3′）替换为argR基因的cr RNA序列（5′-GAATTTC TACTGTTGTAGATTACAGATCATTCCGGCAACA TCGC-3′）以及argF的crRNA序列（5′-GAATTTCTA CTGTTGTAGATGTCCCTCGAGTGGACGCTCCG-3′），然后用Dpn I限制性内切酶消化母本质粒。取3μL消化后的PCR产物通过化学转化法转化到E.coli JM109感受态细胞中，待其长出菌落进行PCR验证并测序验证，得到质粒pJYS3＿ΔcrtYf-1。再以pJYS3＿ΔcrtYf-1为模板，以cr RNA＿argR-F/cr RNA＿argR-R为引物，通过PCR扩增得到除去crtYf基因上下游同源臂的A片段。再以谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032基因组为模板，分别以arg R-F-F/arg R-F-R和argR-R-F/argR-R-R为引物扩增argR的上游和下游同源片段，并将A片段、arg R的上游和下游同源片段进行连接，取5μL连接液热转化至E.coli JM109感受态细胞，待其长出菌落后，以arg R-F-F/arg R-F-R为引物进行菌落PCR和基因测序验证，其中验证正确的打靶质粒命名为pJYS3＿ΔargR。具体构建流程如图2所示。其中引物设计见表3。