《表1 基因克隆和定量PCR分析的引物》

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《柱花草苯丙氨酸解氨酶(SgPALs)对生物胁迫与非生物胁迫的响应》

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参照TRIzol (Invitrogen Inc，美国）方法提取柱花草总RNA，并用TaKaRa公司的PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒合成cDNA第一链，-20℃保存备用。根据柱花草转录组测序结果[24]，利用Oligo 7软件设计SgPAL基因全长引物和定量引物（表1），以cDNA为模板，采用高保真聚合酶Phusion (Thermo）扩增SgPAL的全长片段。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，并进行切胶回收纯化的目的片段，连接到pEASY-T1 (TaKaRa，日本）载体上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，测序分析后获得4个SgPAL基因全长cDNA序列。此外，参考Liu等[25]方法，以柱花草看家基因SgEF-1α为内参，运用SYBR?Premix Ex Taq?II (TaKaRa，日本）定量试剂盒进行Real-time PCR分析，用Rotor-Gene Q (Qiagen，Hilden，德国）进行反应。20μL的反应体系为：10μL 2×SYBR Green PCR master mix，6.4μL Mili-Q无菌水，0.8μL 10μmol/L引物，2μL浓度为200 ng/μL的cDNA模板。反应程序为：95℃1 min，94℃15 s，60℃15 s，72℃30s，循环40次。相对表达量=目的基因表达量/看家基因（SgEF-1α）表达量，定量引物如表1所示。