《表1 Pag4CL3/4CL5基因克隆及定量引物》

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《84K杨4CL3/4CL5基因克隆及生物信息学分析》

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将84K杨野生型植株草炭土培养28天，培养室温度为22±2℃，光照强度为200～300μmol·m-2·s-1，光周期为16 h/8 h。相对湿度为40%。选取长势一致的植株分别取叶、茎、根以及顶芽四个部分用MiniBEST Plant RNA Extraction Kit试剂盒提取RNA，并利用TaKaRa反转录试剂盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser反转录为cDNA。根据已公布的毛果杨（Populus trichocarpa Torr．&A.Gray）基因组信息，设计Pag4CL3基因和Pag4CL5基因特异性引物见表1，以反转录的c DNA为模板，通过PCR方法，克隆出Pag4CL3/4CL5两个基因。PCR反应程序:94℃5 min；94℃30 s，58℃30 s，72℃1 min 45 s，30个循环；最后72℃7 min。用Biospin Gel Extraction Kit试剂盒回收PCR产物，回收产物与p EASY连接载体，转化大肠杆菌感受态细胞（Trans1-T1），涂于LB固体培养基（含50 mg·m L-1卡那霉素），37℃培养12 h后，随机挑取单克隆，用液体LB培养基（含卡那霉素）进行37℃振荡培养，6 h后，用全式金的Easy Pure Plasmid MiniPrep Kit试剂盒提取质粒DNA并进行菌液PCR检测，将阳性单克隆菌液送往哈尔滨擎科生物公司测序。