《表1 巴戟天苯丙烷类代谢公共途径基因克隆及定量引物》

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《巴戟天苯丙烷类代谢途径相关基因的克隆与表达》

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通过分析巴戟天转录组数据和NCBI-blast比对，筛选出3个具有完整开放阅读框的高表达量核心片段（PAL、C4H和4CL各1个），分别命名为Mo PAL、Mo C4H和Mo4CL-like2.使用Primer Premier5软件分别设计5′-RACE和3′-RACE特异性扩增引物（表1）.引物由福州铂尚测序有限公司合成，RT-PCR扩增体系：10×Trans Taq Hi Fi BufferⅡ2.5μL，d NTPs 2μL，引物0.5μL，Hi Fi Polymerase 0.2μL，模板1μL，dd H2O补至25μL.程序：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，35个循环，72℃延伸10 min.将PCR产物切胶后用OMEGA Gel Extraction kit试剂盒（上海易汇生物有限公司）进行纯化，纯化后与p EASY载体连接，连接后转化大肠杆菌感受态细胞（Trans1-T1），涂于LB固体培养基（含50 mg/m L卡那霉素），在37℃培养箱中过夜培养，后随机挑取单克隆，用液体LB培养基（含卡那霉素）进行振荡培养（37℃，220 r/min），振荡培养5 h后进行菌液PCR检测，将阳性单克隆菌液送往福州铂尚测序有限公司测序，测序后进行拼接得到Mo PAL、Mo C4H和Mo4CL-like2全长c DNA序列.