《表3 水稻SP1基因编辑植株q PCR定量》

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《一种基因编辑位点特异性PCR方法的开发和应用》

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将SP1基因编辑水稻SP1-2、SP1-3的基因组DNA分别与野生型DNA按一定比例混合，配制成含有编辑型DNA 5%（B1）、2%(B2）、1%(B3）、0.1%(B4）的盲样，用于荧光定量PCR方法的定量准确性测试。选用PLD基因作为水稻内标准基因，用于定量水稻的总DNA，PLD基因的引物/探针序列详见表1。将编辑水稻SP1-2和SP1-3的基因组DNA梯度稀释，SP1-2基因组DNA浓度梯度为409 400、40940、4094、409.4、81.9 copies·μL-1，SP1-3基因组DNA浓度梯度为371 100、37 110、3711、371.1、123.7 copies·μL-1。用梯度稀释的基因组DNA溶液作为标准品和盲样一起，进行q PCR扩增。根据模板拷贝数和Ct值之间的线性关系分别绘制编辑位点序列和PLD内标基因的标准曲线，SP1-2及相应PLD基因标准曲线的决定系数（R2）都为0.999，标准曲线斜率分别为-3.449、-3.530（图5A）；SP1-3及相应PLD基因标准曲线的R2都为1.0，标准曲线斜率分别为-3.467、-3.487（图5B）。4组标准曲线R2值均大于0.98，斜率均在-3.1～3.6之间，符合标准曲线技术参数的要求，可以用于盲样的定量检测。将盲样的Ct值带入编辑序列和PLD内标基因的标准曲线，计算编辑序列和水稻总DNA的拷贝数，进而计算出盲样中编辑型DNA的百分含量（表3）。