《表1 引物序列：利用CRISPR-Cas9基因编辑技术获得水稻OsMADS56基因突变体》

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《利用CRISPR-Cas9基因编辑技术获得水稻OsMADS56基因突变体》

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在选择的OsMADS56基因的2个单敲除靶位点处分别设计引物，并将合成的引物退火合成目标片段。然后通过BsaⅠ酶切位点将目标片段连入pBIN-sgR-Cas9-Os载体中，然后将含有目标片段的CH载体连接到pCAMBIA1300载体上。通过PCR鉴定和测序确认载体构建成功后，分别命名为pBinOs MADS56-T1、p Bin-OsMADS56-T2。将构建成功的载体转入到农杆菌EHA105，再通过PCR鉴定筛选出含有阳性载体的农杆菌菌株，并侵染野生型水稻的愈伤组织。通过筛选培养、分化培养、生根培养得到成熟的水稻苗。提取叶片DNA，用鉴定引物（M13F和JD-M56-1R，M13F和JD-M56-2R）（表1）分别鉴定2个靶位点的植株是否携带了CRISPR/Cas9载体。用测序引物（JD-M56-1F和JD-M56-1R，JD-M56-2F和JD-M56-2R）（表1）分别对2个靶位点特异性敲除的转基因阳性植株进行PCR扩增，并将扩增片段测序确认靶位点序列变异。特异性鉴定引物扩增的片段长度分别为259 bp，野生型植株不能扩增出目的片段，电泳结果显示T0代5株苗为转基因植株pBin-OsMADS56-T1-9522，4株苗为转基因植株pBin-OsMADS56-T2-9522（图4）。