《表1 CRISPR/Cas9 sgRNA设计软件列表》

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《CRISPR/Cas基因组编辑技术研究进展及其在植物中的应用》

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CRISPR/Cas9系统是目前应用最为广泛的Cas类型，Cas9对不同靶点的切割效率差异很大。需要从多方面着手考虑Cas9的靶点设计:第一，精心进行靶点的筛选。Moreno-Mateos等（2015）发现靶点富集G而缺乏A可以增加sgRNA的稳定性和活性；Chari等（2015）在基于1 400个靶点和sgRNA的基础上开发了sgRNA的评分系统，并表明在离PAM位点-1位置处，G的偏好性强，T的偏好性差。此外，还有许多用于sgRNA效能预测和脱靶位点识别的软件工具（表1）。表1列出了这些工具的名称、主要特征和网址。第二，优化sgRNA骨架序列。Dang等（2015）特异性地将sgRNA延长了10个碱基，并将sgRNA中连续胸腺嘧啶中的第4个突变为胞嘧啶或鸟嘌呤，经过优化的sgRNA使得CRISPR/Cas9系统的敲除能力提高了将近50%。第三，优化sgRNA表达策略。Xie等（2015）利用内源性tRNA处理系统，通过精确地切割tRNA前体的两端提高CRISPR/Cas9系统的靶向性和多重编辑能力。第四，使用特异性启动子启动Cas9基因的表达。在水稻中，用Ubiquitin启动子显然比CaMV35S启动子效率高（Hu等2018b）。在拟南芥中，用CaMV35S启动Cas9基因在T1代只产生了嵌合体而没有纯合子或双等位基因突变（Feng等2013，2014）。然而，将卵细胞特异性启动子用于Cas9的转录翻译可以在T1代生成三突变体（Wang等2015c；Yan等2015；Mao等2016）。Feng等（2018）选择玉米减数分裂特异基因DMC1的启动子用于驱动Cas9基因的表达，能够在配子中实现高效的基因组编辑，T0代植株中获得60%～70%的纯合或双等位的突变体。这种突变能够稳定遗传到T1代，实现了玉米基因组的高效编辑。