《表1 CRISPR/Cas9多重编辑系统4种构建策略的比较》

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《多重基因组编辑中CRISPR-Cas9系统和CRISPR-Cpf1系统的应用和比较》

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CRISPR/Cas9多重编辑系统的不同构建策略已被用于修饰各种生物体中的多个基因，例如结合几个Pol III启动子盒和sg RNA的多重系统[25-26]、利用单个转录物表达多个g RNA的Csy4核糖核酸酶系统[17]。4种构建策略各有优缺点（表1）。（1）Golden Gate Assembly构建策略适用于不同水平的构建体装配，具有高效率及可编程性。但由于其依赖于IIS型限制酶，所以需要从载体中消除Bsa I位点，通常需要对扩增的序列以及其他entry clone进行测序以确认不存在PCR衍生的突变。研究表明，Bsa I位点具有6个碱基对识别序列，因此对于GC含量为50%的基因组，Bsa I限制位点平均每4 Kb出现一次[27]。所以在选择构建策略时，需要考虑到实验对象生物体的基本成分来判断Bsa I限制位点的频率。（2）MLEC构建策略的特点在于使用了病毒载体，AVV病毒载体可以解决CRISPR/Cas系统在体内对受感染细胞的有效传递问题。该策略能够将多重编辑技术与病毒载体结合起来，极大地扩展CRISPR/Cas9系统在体内靶向肝脏、神经、肌肉和肿瘤组织的治疗潜力。但需要注意的是，在使用过程中，慢病毒载体可能会导致一系列生物安全性问题，例如导致插入突变或产生具有复制能力的病毒等[28]。（3）Csy4-Cleavable Cassettes策略通过一个多顺反子的转录本表达g RNA。Csy4的功能已在细菌，古细菌和真核生物中得到证实[29]，还具有靶向治疗HIV-1的潜力[30]，适用于各种生物体的基因组编辑，应用较为广泛。（4）PTG Cassettes策略也属于利用单个转录物表达多个g RNA的策略，具有比Csy4-Cleavable Cassettes强大和精确的功能，并适用于更复杂的Cas9应用，tRNA也可作为内部增强子或启动子来增强Pol III转录效率。与上述3种方法相比，PTG使用内源性t RNA处理系统，而不引入可能对细胞有毒的其他成分，以及t RNA（约70 bp）小于核酶（约200 bp）和Pol III启动子（通常为200～300 bp），更方便进行载体包装，所以PTG未来应用于CRISPR-Cas9系统在基因治疗中的限制较少[23]。