《表1 载体构建所用引物：棉花黄萎病菌VdHP1的克隆及功能分析》

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《棉花黄萎病菌VdHP1的克隆及功能分析》

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构建针对VdHP1的敲除载体，先用引物Vd HP1up-F和Vd HP1 up-R从V592菌株的基因组中扩增Vd HP1基因上游780 bp片段，再用引物Vd HP1 down-F和VdHP1 down-R从V592基因组DNA中扩增VdHP1基因下游782 bp片段。将获得的2个目标片段与PacⅠ线性化的敲除载体通过多片段重组酶（Vazyme）进行重组构建敲除载体p GKO-HPT::VdHP1，再将其通过ATMT方法转化V592菌株的分生孢子。将获得的转化子参考WANG等[23]的PCR方法进行初步筛选。再分别用HPH的特异引物Hyg U和Hyg L，及VdHP1的特异引物VdHP1 full-F和VdHP1 full-R对转化子进行再次筛选。为了获得互补菌株，用引物ECVd HP1-F和ECVd HP1-R从V592菌株的基因组DNA中扩增VdHP1基因编码区全长，将其插入到Xba I/Bam H I线性化的互补载体中，通过ATMT转化Vd HP1基因敲除突变体，对转化子用抗生素G418和PCR方法进行筛选。为了获得Vd HP1基因过表达菌株，用引物对OEVdHP1-F和OEVdHP1-R从V592菌株中扩增VdHP1基因编码区全长，插入到Xba I/Spe I线性化的p SUIPH-RG-HPT载体中。然后通过ATMT方法将该载体转化V592菌株。最后，用引物Vd HP1-q PCR-F和Vd HP1-q PCR-R通过RT-q PCR对目标基因Vd HP1在野生型菌株、敲除突变体菌株、互补菌株和过表达菌株中的转录表达进行确定。载体构建所用引物见表1。