《表1 换锦花LsMYB4和LsMYB5基因克隆和VIGS载体构建所用引物》

《表1 换锦花LsMYB4和LsMYB5基因克隆和VIGS载体构建所用引物》   提示:宽带有限、当前游客访问压缩模式
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《基于VIGS基因沉默体系的换锦花LsMYBs基因功能研究》


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LsMYB:换锦花MYB转录因子;下同

采用改良十六烷基溴三甲基化铵(hexadecyltrimethyl ammonium bromide,CTAB)法提取换锦花花瓣总RNA,Prime Script 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒(TaKaRa,大连)反转录合成cDNA第1链。根据LsMYB4和LsMYB5已知序列设计特异性引物(表1)扩增LsMYB4和LsMYB5基因的CDS全长序列,PCR扩增体系(20μL):dNTP 0.2μmol/L,上、下游引物0.5μmol/L,换锦花cDNA 40 ng,Ex Taq 1U;各成分浓度为终浓度。扩增程序:95℃5 min;95℃30 s,55℃30 s,72℃1 min,35次循环;72℃8 min。再根据pTRV2载体序列和酶切位点,设计无缝克隆引物(表1),采用无缝克隆技术(TaKaRa,大连)构建4个LsMYB4(cDNA全长681 bp)和LsMYB5(cDNA全长606 bp)基因的pTRV2表达载体(插入片段分别为400 bp和LsMYBs基因cDNA全长序列),分别命名为pTRV2-LsMYB4-400、pTRV2-LsMYB4-681、pTRV2-LsMYB5-400和pTRV2-LsMYB5-606,采用电击法将各重组载体、pTRV1∶pTRV2(1∶1)(阴性对照)转入农杆菌GV3101。