《表1 实时荧光定量PCR扩增引物》

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采用实时荧光定量PCR法在Quant StudioT M6 F l e x定量P C R仪（T h e r m o F i s h e r S c i e n t i f i c，Singapore）上测定AOA、AOB及Comammox分支A（Clade A）和分支B (Clade B）amoA基因的拷贝数。实时荧光定量PCR所用的扩增引物如表1所示。AOA、AOB、Comammox Clade A、C o m a m m o x C l a d e B的a m o A基因定量P C R所用反应体系均为20μL，主要包含：待扩增的模板DNA1μL、上下引物及ROX染料各0.4μL，Taq D N A聚合酶1 0μL、灭菌水7.8μL。通过液体LB培养基培养含有目的基因的克隆子，按试剂盒（MiniBEST Plasmid Purification Kit）说明书方法提取、纯化质粒后，在NanoDrop?ND-1000 UV-Vis分光光度计上测定质粒的浓度，并计算出目的基因的拷贝数。最后用TE缓冲溶液将质粒连续稀释6～8个梯度以制作定量PCR的标准曲线。AOA、AOB的实时荧光定量PCR扩增程序皆为95℃预变性30 s；95℃变性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸45 s，40个循环。Comammox Clade A、Clade B的实时荧光定量PCR扩增程序皆为95℃预变性3 min；95℃变性30 s，52℃退火45 s，72℃延伸1 min，45个循环。