《表1 三疣梭子蟹Pt Cht1基因克隆和实时荧光定量所用引物序列》

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《三疣梭子蟹几丁质酶基因1的克隆及功能鉴定》

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随机取8只（雌雄各4只）暂养后四肢健全且充满活力的健康三疣梭子蟹，解剖取样，包括心脏、肝胰腺、肠、鳃、胸神经节、肌肉、脑、眼柄、胃、表皮、精巢和卵巢，液氮冷冻后，将所有样品的同一组织混合后进行研磨，Trizol法提取总RNA，通过Thermo的Nano Drop 2000核酸定量仪与1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，选取高质量的总RNA，混匀后用SMARTTM RACE Amplification Kit合成用于3′和5′RACE的c DNA模板。依据三疣梭子蟹高通量测序数据库中Pt Cht1的已知表达序列标签（Expressed Sequence Tag，EST），运用Primer Premier 5.0软件设计3′和5′RACE特异性引物（Pt Cht1 F和Pt Cht1 R）、通用引物（UPM）和ORF验证引物（Pt Cht1 Fi和Pt Cht1Ri）（表1）。利用Advantage 2 PCR Kit对3′和5′末端进行扩增。纯化后的扩增产物与p MD18-T载体连接后转入DH5α大肠杆菌感受态细胞中扩大培养，挑取阳性单克隆，利用DNA测序通用引物M13-47/48进行菌落PCR鉴定，将目的产物送至睿博生物公司进行测序。利用Vector NTI 11.0去掉测序结果中冗余序列后，拼接获得完整的基因序列。