《表1 本研究中所使用的引物》

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《圆斑星鲽(Verasper variegatus)wt1基因的克隆与表达分析》

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从山东省烟台天源水产有限公司采集圆斑星鲽不同发育时期的胚胎，包括单细胞期（卵裂前胚盘隆起时期）（0h）、2细胞期（4h）、8细胞期（10h）、16细胞期（12h）、32细胞期（13h）、桑椹期（18h）、高囊胚期（20h）、低囊胚期（26h）、原肠早期（27h）、原肠中期（29h）、原肠晚期（77h）、神经胚期（98h）、晶体形成期（136h）、心跳出现期（163h）、孵化前期（188h）、脱膜孵化期（197h），不同时期的仔稚鱼（孵化后5d，10d，20d，30d，45d，58d，68d，78d，92d）及雌雄成鱼[体长（24.0±0.5）cm，体重（330±20）g]的不同组织（脑、眼、鳃、心、肝、肠、脾、性腺、肾及肌肉），将采集的样品用液氮充分研磨，根据Trizol（Ta Ka Ra）实际说明书提取各组织的总RNA，经Thermo紫外分光光度计（Nano Drop 2000）和1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测，将高质量的RNA用SMARTTM RACE c DNA Amplification RACE（Ta Ka Ra)试剂盒分别合成3’RACE和5’RACE c DNA。之后根据本实验室构建的转录组数据库获得wt1a和wt1b基因的EST序列，利用Primer Primer 5.0软件设计wt1a和wt1b基因的3′RACE和5′RACE特异性引物（表1），以圆斑星鲽成鱼性腺组织c DNA为模板分别进行扩增，PCR反应体系（20μL）为:Premix TaqTM （LA TaqTM Version 2.0）10μL、3’或5’特异性引物0.8μL、UPM（或NUP）0.8μL、RACE-c DNA 1μL及dd H2O 6.4μL。PCR反应条件为:94°C 5min；94°C 30s，3’或5’特异性引物温度30s，72°C 1min，35个循环；72°C 10min。扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，并在紫外线下切胶，并用San Prep柱氏DNA凝胶回收试剂盒回收，利用PMD18-T Vector试剂盒(Ta Ka Ra）进行连接（PMD18-T Vector 1μL，Solution I 5μL及纯化产物4μL），16°C反应3h。之后将连接液加入融化好的DH5α（Code No9057，Ta Ka Ra）中培养，挑取阳性单克隆，经菌落PCR鉴定后，筛选目的菌液送至华大基因进行测序。