《表2 引物序列：水牛SIRT6基因shRNA干扰慢病毒载体构建与验证》

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《水牛SIRT6基因shRNA干扰慢病毒载体构建与验证》

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将BFF解冻复苏后，传至第4代，待细胞汇合度为60%左右时，每皿细胞分别加入1 mL病毒液和2 mL细胞培养液，再添加6μg/mL Polybrene促进感染。在第1次病毒感染16～18 h后弃细胞培养液进行第2次感染，加入1 mL病毒液和2 mL细胞培养液重新感染至细胞汇合度至95%以上，观察绿色荧光表达情况，并传代进行后续实验。每处理重复3次，以未转染外源基因的细胞为空白对照组，转染Psi-LVRU6GP空载体作为质粒对照组。1.3.5水牛成纤维细胞SIRT6基因的mRNA表达用Trizol法分别提取2个处理组与2个对照组水牛成纤维细胞的RNA，反转录获得cDNA，以β-actin为内参基因，通过qRT-PCR反应检测SIRT6基因的mRNA表达量。反应体系20μL：上、下游引物各0.4μL，模板（100 ng/μL)1μL，2×chamQ Universal SYBR qPCR Master Mix10μL，三蒸水补至20μL。反应程序为95℃预变性5 min，95℃变性15 s、60℃退火50 s，变性、退火40个循环。引物序列见表2。每个样本重复3次，采用2-△△CT方法计算目的基因的表达情况。