《表2 PCR引物序列：一种经microRNA敲低PD-1的新型慢病毒载体在CAR-T细胞中的应用》

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《一种经microRNA敲低PD-1的新型慢病毒载体在CAR-T细胞中的应用》

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我们设计了慢病毒质粒plenti-EF1α（mi RNA-30-backbone）-GFP、plenti-EF1α（mi RNA#1）-GFP、plenti-EF1α（miRNA#61）-GFP，并以由U6启动子转录miRNA的慢病毒质粒plenti-EF1α-GFP-U6-miRNA#61作为对照（图1A）。我们基于miRNA-30骨架（miRNA-30-backbone）设计了两种miRNA（分别针对PD-1基因3′UTR的miRNA-30#PD-1#1和CDS区的miRNA-30#PD-1#61），其中miRNA序列经BglⅡ酶切位点插入到启动子EF1α的内含子中（表2）。将上述目的质粒经第3代慢病毒包装系统得到相应慢病毒颗粒并转导至Jurkat细胞，通过流式细胞术检测Jurkat细胞中的报告基因GFP表达情况，以比较在相同条件下不同慢病毒载体上目的基因的表达效率。如图1B所示，经慢病毒LV-EF1α-GFP（阳性对照）、LV-EF1α（miRNA-backbone）-GFP、LV-EF1α（miRNA#1）和LV-EF1α（miRNA#61）-GFP转导的Jurkat细胞的GFP表达率显著高于经慢病毒LV-EF1α-GFP-U6-miRNA#61转导的Jurkat细胞。该结果表明，相对于传统携带miRNA的慢病毒载体，将miRNA插至EF1α内含子中的慢病毒载体的转基因表达效率更高。