《表1 引物序列：蝴蝶兰亲环素基因PhCyP的克隆及表达分析》

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《蝴蝶兰亲环素基因PhCyP的克隆及表达分析》

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根据NCBI上登录的同源序列（XM＿020833376、KP719975、KU942511、XM＿020728710、GU942927）设计1对简并引物CyP-F和CyP-R，用于中间片段的扩增，预期452 bp，PCR扩增体系为25μL，含10×buffer 2.5μL，cDNA模板1000～2000 ng，dNTP600μmol/L，每条引物0.5μmol/L，TaqDNA聚合酶1 U。扩增程序为：95℃变性5 min；95℃30s，58℃30 s，72℃30 s，35个循环；72℃延伸10 min。凝胶回收目的片段，连接到pGEM-T EASY载体上，转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，进行测序。根据中间片段设计3?端特异引物3?-outer和3?-inner，5?端特异引物5?-outer和5?-inner，采用SMARTTM RACE Amplification kit(Clontech）进行目的基因的RACE扩增。将5?端序列、中间序列和3?端序列拼接，获得目的基因cDNA的全长。在此基础上，设计1对引物ORFF和ORFR，跨越开放阅读框（ORF），预期691 bp，进行ORF的扩增和测序，进一步进行序列验证。引物设计和序列拼接采用Primer 5.0和DNAMAN软件，引物合成和测序由上海英潍捷基公司完成。