《表1 引物序列：蝴蝶兰一个C3型PEPC基因的克隆及其低温胁迫下的表达分析》

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《蝴蝶兰一个C3型PEPC基因的克隆及其低温胁迫下的表达分析》

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采用RNAprep Pure Plant Kit（天根）提取所有组织材料的总RNA，利用M-MLV反转录酶（TaKaRa）将低温处理3 d叶片的总RNA进行反转录为cD-NA；根据NCBI上已登录的PEPC基因序列设计1对简并引物PEPC-F1和PEPC-R1（表1），预期2 285 bp；利用上述cDNA和引物进行PCR扩增，扩增体系为20μL，含10×Buffer 2.0μL，每条引物0.5μmol/L，dNTP 600μmol/L，Taq DNA聚合酶1 U，cDNA模板1 000～2 000 ng。PCR扩增程序为：95℃变性5 min；95℃50 s，56℃50 s，72℃2 min，35个循环；72℃延伸10 min。凝胶回收目的片段，连接到pGEM-T Easy载体上，转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，进行测序，得到目的基因的中间片段。根据得到的序列，分别设计1对5'端特异引物和1对3'端特异引物（表1），采用SMARTTMRACE Amplification Kit（Clontech）进行扩增，回收扩增产物，连接到pGEM-T Easy载体上，转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，分别进行测序。将中间保守片段、5'端和3'端序列拼接得到蝴蝶兰PhPEPC基因的cDNA全长。在此基础上，在PhPEPC基因的编码区设计1对引物（表1），进行开放阅读框区域的PCR扩增，扩增体系和程序同前，对基因序列再次进行测序和验证。