《表1 本研究所用引物：滑液支原体WVU1853株pdhA、pdhB的原核共表达及表达产物酶活性分析》

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《滑液支原体WVU1853株pdhA、pdhB的原核共表达及表达产物酶活性分析》

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加粗下划线:分别为限制性内切酶NdeⅠ，XhoⅠ，Bam HⅠ和SacⅠ的酶切位点；加粗斜体碱基:点突变位点，使终止密码子TAG突变为TAC，从而使翻译继续

pETDuet-AB的构建：基于质粒pETDuet-1、pET-28a（+）及MS基因pdhA和pdhB的序列及酶切位点分析，设计引物（表1），以提取的MS DNA为模板，以α-Fd/α-Rd引物对扩增pdhA、以β-Fd/β-R引物对扩增pdhB基因。由于pdhA内有8个TGA密码子，其在MS中编码色氨酸，但在大肠杆菌中为终止密码子。因此设计点突变引物对αm1-F/αm1-R、αm2-F/αm2-R、αm3-F/αm3-R、αm4-F/αm4-R、αm5-F/αm5-R、αm6-F/αm6-R、αm7-F/αm7-R及αm8-F/αm8-R，并应用Over-lap PCR完成pdhA基因的优化（TGA→TGG），A基因各片段的扩增：总体积50μL:2×PrimeSTAR HS DNA Polymerase 25μL，DNA基因组2μL，分段扩增片段上下游引物（10 nmol/mL）各1μL，ddH2O 21μL。反应条件：98℃5 min；98℃25 s，57.5℃25 s，72℃25 s，30个循环。A基因Overlap-PCR突变：总体积50μL:2×PrimeSTAR HS DNA Polymerase 25μL，DNA分段扩增产物各0.5μL，α-Fd与α-Rd（10 nmol/mL）各1μL，ddH2O 19μL。反应条件如上所述。B基因扩增：总体积50μL:2×PrimeSTAR HS DNA Polymerase 25μL，DNA基因组2μL，β-Fd与β-R（10 nmol/mL）各1μL，ddH2O 21μL。反应条件如上所述。将优化后的pdhA及pdhB与pETDuet-1经相应酶切后连接，构建原核共表达载体，阳性质粒命名为pETDuet-AB。，将优化后的pdhA及pdhB与pETDuet-1经相应酶切后连接，构建原核共表达载体，阳性质粒命名为pETDuet-AB。