《表1 实验所用引物：蓝杆藻ATCC51142中琥珀酸半醛脱氢酶的原核表达及生化表征》

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《蓝杆藻ATCC51142中琥珀酸半醛脱氢酶的原核表达及生化表征》

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注：引物序列中下划线为相应酶切位点.

根据蓝杆藻ATCC51142中cce4228基因序列设计特异性引物（表1），以蓝杆藻ATCC51142基因组为模板进行PCR扩增。PCR反应体系：模板1μL（约30 ng），上、下游引物（终浓度0.2μmol/L）各1μL，2×Taq Mix 25μL，灭菌水22μL。PCR反应条件：95°C 3 min；95°C 30 s，52°C 30 s，72°C2 min，30个循环；72°C 10 min。PCR扩增产物通过1%琼脂糖凝胶电泳分离纯化后加入Nde I和Xho I限制性内切酶进行双酶切。用同样的方法双酶切pET-28a载体。然后将酶切后纯化回收得到的cce4228基因片段和pET-28a载体线性片段（基因片段与载体片段的摩尔比为6:1）在16°C金属浴恒温下用T4 DNA连接酶过夜连接。连接产物5μL转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞（100μL）后，用含有50μg/mL卡那霉素的LB固体平板培养基筛选阳性克隆。将经菌落PCR验证正确的阳性克隆单菌落摇菌提取质粒后送检测序。