《表1 羽衣甘蓝Bo PDIL1-2基因克隆及原核表达分析所用引物》

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《羽衣甘蓝类蛋白质二硫键异构酶PDIL1-2的基因克隆及蛋白表达分析》

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利用CTAB法从羽衣甘蓝柱头中提取总RNA[29]。使用DnaseⅠ酶（RNase free）消化后的柱头总RNA作为模板，采用锚定引物Oligo（d T）18和AMV反转录酶（TaKaRa）进行RNA反转录，程序为:42℃孵育30 min，99℃变性5 min，4℃孵育5min。根据GenBank数据库中已经发表甘蓝PDIL1-2基因的5'和3'末端序列，设计一对特异性引物PDIL1-2-RT-For和PDIL1-2-RT-Rev（表1），模板为反转录产物cDNA的第1条链，使用LA taq DNA聚合酶（TaKaRa）进行PCR扩增。扩增条件为:94℃预变性2 min，94℃变性30 s，60℃退火30s，72℃延伸2 min，进行35次循环后，72℃延伸7min。用E.Z.N.A.TMGel Extract kit对PCR产物进行回收，回收后与p GEM-T载体连接，转化到Top10菌株中，用蓝白斑筛选法挑选阳性克隆并检测核酸序列。