《表1 本研究所用引物：花椒窄吉丁化学感受蛋白AzanCSP3的cDNA克隆及原核表达》

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《花椒窄吉丁化学感受蛋白AzanCSP3的cDNA克隆及原核表达》

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下划线分别表示内切酶EcoRⅠ（GAATTC）和XhoⅠ（CTCGAG）酶切位点；AzanCSP3：花椒窄吉丁化学感受蛋白；下同

根据本实验室测得的花椒窄吉丁转录组数据，以花椒窄吉丁雌虫触角cDNA为模板，根据前期的转录组测序注释到的候选AzanCSP3基因序列设计PCR特异性引物（表1）扩增其完整编码序列。其中PCR的反应体系和扩增条件参照反应试剂盒（Golden Easy PCR System）的方法，qRT-PCR反应体系（25μL）:cDNA模板<1μg，10μmol/L上、下游引物各1μL，2×Reaction Mix 12.5μL，用ddH2O补足至25μL。PCR反应程序：94℃3 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃1 min，35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，将符合预期大小的DNA片段回收、纯化后连接到克隆载体pMD18-T上，然后转入实验室制备的E.coli DH5α感受态细胞中，后经由蓝白斑筛选后随机挑取5个阳性菌落至含有Amp抗性的液体培养基中在37℃，220 r/min的条件下振荡培养12～16 h，然后将培养所得的新鲜菌液按送样要求制备，送北京奥科生物科技有限公司测序。