《表2 实时荧光定量PCR的引物序列》

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《对乳头状甲状腺癌临床分子靶标的筛选》

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用DNA-free Kit DNase Treatment and Removal Reagents (Thermo Fisher Scientific，美国）处理RNA中残留的DNA，用SuperScript誖ⅢFirst-Strand Synthesis SuperMix (Thermo Fisher Scientific，美国）在20μL反应体系中（详细参见试剂说明书）进行cDNA合成。以PPIA作为内参基因，对10个NF-κB信号通路相关基因进行相对定量分析。引物设计详见表2，序列由上海生工生物公司合成。PCR反应体积为10μL，包括2×SsoFast Evagreen Supermix (BioRad，美国）5μL，cDNA模板1μL，上下游引物（20μmol/L）各0.2μL，无核酸酶水3.6μL。以无DNA模板的反应体系（只加无核酸酶水）作为阴性对照。所有样品进行双孔复孔检测，取循环阈值（Cycle threshold，Ct）的平均值，用靶基因与内参基因的比值（ΔCt）来计算每个靶基因的相对表达量。PCR反应条件为，95℃30 s，95℃5 s，57℃20 s，共40～50个循环；熔解曲线为95℃10 s，65℃60 s，97℃1 s。