《表2 实时荧光定量PCR引物序列》

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《基于第二代DNA测序技术的肺腺癌相关环状RNA生物信息学分析》

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在筛选出的所有差异表达的circRNA中，随机选取5种circRNA(hsa＿circ＿0072309、h s a＿c i r c＿0 0 0 8 2 3 4、h s a＿c i r c＿0 0 0 0 1 9 9、hsa＿circ＿0008870和hsa＿circ＿0000097）。采用实时荧光定量PCR检测30对肺腺癌及癌旁组织中的表达水平，用以验证二代测序结果的准确性。5个circRNA和内参照GAPDH基因的引物序列如表2所示。第一步按照PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒提供的操作说明将提取的RNA反转录为cDNA，每个反应体系包括总RNA 500 ng；第二步以cDNA为模板，按照SYBR?Green Real time PCR Master Mix试剂盒操作说明行实时荧光定量PCR检测，反应体系包括SYBR?Green Realtime PCR Master Mix、circRNA特异上、下游引物及Nuclease-Free Water，每个反应样品设置3个复孔。反应条件：95℃变性30 s，95℃5 s、退火55℃10 s、延伸72℃15 s，共40个循环。以2-ΔΔCt值表示5个circRNA的相对表达量。