《表2 实时荧光定量PCR引物序列》

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《适宜浓度的维生素E促进半滑舌鳎生长激素基因的表达》

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在GeneBank中获得半滑舌鳎生长激素基因序列（HQ334196），通过Primer Premier 5软件进行引物设计，由生工生物工程（上海）股份有限公司进行合成，引物浓度为10μmol/L。应用实时荧光定量PCR（qPCR）分析不同水平维生素E条件处理下生长激素基因的表达情况。以20×cDNA稀释液为模板，进行荧光定量PCR扩增，参照TB Green Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）（Code No.RR820A）试剂盒说明，扩增体系为20μL（包括10μL TB Green Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus），0.8μL PCR Forward Primer，0.8μL PCR Reverse，1μL cDNA模板，7.4μL RNase-free dH2O)。为减小实验误差，每个样品均设置3个重复，18S核糖体RNA基因作为内参引物[21]，与目的基因在相同条件下进行扩增，引物序列见表2。反应按95℃10 min，95℃10 s，58.4℃15 s，72℃20 s，再依次按照95℃15 s，60℃15 s，95℃15 s绘制溶解曲线。实验中PCR产物通过溶解曲线确定扩增准确性及特异性，使用2–??Ct法计算mRNA相对表达水平[22]。