《表1 巢式PCR检测疟原虫种类的引物》

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《辽宁省2017年5例输入性卵形疟疾的实验室诊断》

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吸取200μl全血，用QIAGEN商品化核酸提取试剂盒按照说明书操作提取100μl核酸样本，-20℃保存。按文献[2-4]合成能够扩增针对疟原虫18S rRNA目的基因的序列引物（表1），引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。（1）反应体系:10×Buffer缓冲液2.5μl，dNTP（2.5 mmol/L）2μl，Taq聚合酶（5 U/μl）0.125μl，正向、反向引物（10μmol/L）各1μl，模板2μl，用ddH2O补足至25μl。（2）反应条件:94℃预变性3 min，94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸60 s，共扩增34个循环；72℃延伸5 min。第1轮为疟原虫的属引物，第2轮为恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）、间日疟原虫（P.vivax）、三日疟原虫（P.malariae）和卵形疟原虫（P.ovale）4种型别的特异性引物，将第1轮PCR产物2μl作为扩增第2轮PCR的模板。第2轮所需的反应体系和扩增条件与第1轮相同，用1%琼脂糖凝胶电泳来鉴定扩增产物，在凝胶成像系统中紫外灯照射条件可见清晰的条带。将测序后的阳性产物序列在GenBank基因库中进行BLAST比对和同源性分析，检测结果显示出扩增片段与预期结果一致。