《表1 本研究中所用PCR引物》

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《组合策略促进碱性果胶酶在毕赤酵母中高效表达》

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注:下划线为DNA限制性内切酶识别位点

1) PGL表达载体p PIC9K-PGL构建研究发现不同物种对密码子使用频率不同，P.pastoris对密码子显示出偏好性，也将在翻译阶段调控基因表达[12-13]。基于P.pastoris密码子偏好性对PGL高热稳定性突变体K314M的基因优化，并克隆至宿主pUC57（金斯瑞生物科技有限公司）。以pUC57-PGL为模板，用引物PGL-F/R（表1）扩增PGL基因，PCR扩增条件:95℃预变性5 min；随后进行34个循环（95℃30 s，60℃30 s，72℃1.5 min），最后72℃保温10 min。载体p PIC9K用Eco R I及Not I双酶切，PCR片段及酶切后的载体柱回收，根据One Step Cloning Kit试剂盒说明书进行重组连接，连接产物转化E.coli TOP10，质粒提出得到PGL表达载体p PIC9K-PGL。未经密码子优化的K314M基因通过引物PGLN-F和PGLN-R从pET-22b（+）/pgl扩增得到，并克隆至p PIC9K中Eco R I-Not I位点，得到表达载体p PIC9K-PGLN。