《表1 本研究所用的PCR引物》

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《梅花PmWRKY40基因的克隆及其表达分析》

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利用艾德莱（北京）公司EASY spin植物RNA快速提取试剂盒提取梅花叶片组织的总RNA，以此为模板，采用TaKaRa（大连）公司的反转录试剂盒PrimeScriptRT reagent Kit With gDNA Eraser (Perfect Real Time）反转录成cDNA备用，具体操作根据说明书进行。结合笔者所在课题组前期从‘雪梅’低温表达谱中筛出的候选基因（未发表）和梅花基因组上公布的PmWRKY40基因序列信息，通过Primer Premier 5.0软件设计全长特异引物，以‘雪梅’低温处理12h后反转录成的cDNA为模板，进行PCR扩增，克隆PmWRKY40基因。扩增条件为：94℃预变性4 min；94℃30s，59℃30s，72℃30s，36个循环；72℃延伸10min。PCR扩增产物经胶回收试剂盒回收后连接到pMD18-T载体上（TaKaRa），转化大肠杆菌DH5α感受态细胞（北京全式金生物技术有限公司）后送往上海生工生物工程有限公司测序。全长序列扩增、菌落PCR检测和测序所用引物见表1。