《表1 本研究PCR和RACE反应所用引物》

  提示：宽带有限、当前游客访问压缩模式

本系列图表出处文件名：随高清版一同展现

《沙葱萤叶甲表皮蛋白基因GdAbd的克隆及对温度胁迫的响应》

1. 获取 高清版本忘记账户？点击这里登录

1. 下载图表忘记账户？点击这里登录

沙葱萤叶甲表皮蛋白基因中间片段克隆:根据本课题组测得的沙葱萤叶甲转录组数据，筛选注释为沙葱萤叶甲表皮蛋白的unigene序列，通过生物信息学分析得到表皮蛋白基因片段。利用Primer Premier 5.0软件设计1对引物GdAbd-A和GdAbd-S（表1），以沙葱萤叶甲2龄幼虫反转录得到的cDNA为模板进行qPCR扩增。25μL qPCR反应体系:100 ng/μL cDNA模板1μL、0.2μmol/L上下游引物各1μL、Go Taq?q PCR Master Mix 12.5μL及RNasefree Water 9.5μL。PCR扩增条件:94℃预变性3 min；94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸2 min，25个循环；72℃延伸7 min。产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，然后对产物进行回收，与p MD-19T载体连接，连接产物转入感受态细胞大肠杆菌DH5α中进行转化，吸取转化后产物200μL涂布含有氨苄西林的抗性LB平板上，过夜培养12～16 h，而后进行蓝白斑筛选。挑取平板上的菌落进行PCR鉴定后，将条带清晰、片段长度相符的合格菌落接种于含有10 mg/mL氨苄西林1.0 mL的LB液体培养基中，37℃、220 r/min摇床过夜培养12～16 h。然后根据质粒提取试剂盒操作说明提取菌液中的质粒，将提取的质粒送往北京六合华大基因科技股份有限公司进行测序验证。