《表1 实验所用引物：尼罗罗非鱼TRAF4基因的克隆、表达及功能分析》

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《尼罗罗非鱼TRAF4基因的克隆、表达及功能分析》

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以上述获得的鳃c DNA为模板，使用引物对TRAF4-sf1和TRAF4-sr1（表1）扩增TRAF4基因的上游片段。PCR反应体系（50.0μL）:cDNA模板1.0μL、上下游引物（20μmol/L）各1.0μL、10×LA PCR buffer（含Mg2+）5.0μL、d NTP Mixture（2.5mmol/L）4.0μL、LA Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.5μL、灭菌ddH2O 37.5μL。PCR反应条件:94℃预变性3 min；94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，30个循环；72℃延伸10 min；4℃保存。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，以凝胶DNA微量回收试剂盒进行纯化。然后将上述胶回收产物连接到pMD19-T载体，转化大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α，涂板并挑取单菌落至1 mL液体培养基，过夜培养后进行菌液PCR鉴定，筛选阳性克隆送至广州生工生物工程有限公司进行测序。