《表1 实验所用引物：杂交鳢CmaZAP-70基因的克隆、表达及其功能分析》

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《杂交鳢CmaZAP-70基因的克隆、表达及其功能分析》

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下划线为酶切位点

采用RNeasy?Mini Kit试剂盒对所有样品进行总RNA提取，1.2%琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop1000微量紫外分光光度计（Thermo，美国）检测总RNA质量。随后按5×All-In-One RT MasterMix说明书合成一链cDNA，于-20℃存放备用。对本实验室的杂交鳢转录组数据进行分析，并用Primer Premier 5.0软件对获得的ZAP-70序列设计特异性引物（表1），以脾脏cDNA为模板进行ZAP-70基因扩增，20μL PCR体系包括10×PCR Buffer（Mg2+Plus）2μL、dNTP Mixture（各2.5 mmol/L）1.6μL、10μmol/L上、下游引物各0.8μL、LA Taq（5 U/μL）0.2μL、cDNA 0.8μL、RNase-free H2O 13.8μL。PCR程序为94℃3 min；接着94℃30 s，54℃30 s，72℃2 min（35个循环）；然后72℃5 min；4℃保存。电泳检测PCR产物，采用E.Z.N.A?Gel Extraction Kit将目的片段进行纯化回收，随后连接至pMD 18-T载体，转化E.coli DH5α，涂板，挑菌，菌液PCR法验证阳性克隆，送测序。