《表1引物：尼罗罗非鱼Cullin-1基因克隆及表达》

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《尼罗罗非鱼Cullin-1基因克隆及表达》

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根据本实验室所测得的罗非鱼转录组数据（https://www.ncbi. nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA244908)，利用Primer Premier 5.0分别设计CUL1克隆引物On-CUL1 F/R和荧光定量引物On-CUL1-436F/On-CUL1-532R（表1），以 β-actin为内参。以罗非鱼脾脏c DNA为模板，利用引物On-CUL1 F/R对罗非鱼CUL1基因编码序列片段进行扩增，反应体系（20 μL）:Premix Taq 10 μL，dd H2O 7 μL，c DNA模板1 μL，On-CUL1 F/R各1 μL。反应条件：94 ℃ 5 min、94 ℃ 30 s、 52 ℃ 30 s、72 ℃ 2 min 20 s，33个循环；72 ℃ 10 min，4 ℃下保存。PCR产物经电泳检测、目的条带切胶回收后与载体p MD 18-T连接，连接产物转化至DH5α 感受态细胞，涂布于含Amp+的LB琼脂平板，于37 ℃条件下培养12 h。挑取单菌落于含Amp+的LB液体培养基，于37 ℃、200 r/min条件下培养1 h，通过菌落PCR鉴定，阳性菌送生工生物 (广州）股份有限公司测序。