《表1 本研究所使用的引物》

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《利用CRISPR/Cas9技术创制水稻落粒性基因qSH1突变体及突变特征分析》

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参照Ma等（2015）的方法构建单靶点表达载体Cas9-qSH1-T1，具体步骤如下:（1）含T1靶点的gRNA-U3载体的构建:分别合成带有粘性末端的寡链靶点引物T1F/T1R（表1）。将2对寡链靶点引物95℃变性后冷却至室温完成退火，再将退火后的双链靶点片段接连到gRNA-U3载体上，并利用UF/gR引物（表1）PCR扩增获得含有T1靶点片段的gDNA表达盒U3-T1-gRNA。扩增体系（20μL）为:UF/gR引物（10μmol/L）各0.5μL，2×buffer 10μL，KOD FX酶（1.0 U/μL）0.5μL，dNTP（2 mmol/L）2μL，模板2μL，ddH2O 4.5μL；反应程序为:95℃预变性1 min，95℃10 s、60℃15 s、68℃20 s，10个循环，95℃10 s、60℃15 s、68℃30 s，20个循环。（2）构建含T1靶点片段的CRISPR/Cas9表达载体:用接头引物b1/BL（表1）PCR扩增U3-T1-gRNA表达盒，扩增体系（30μL）为:上下游引物（10μmol/L）各0.5μL，2×buffer 15μL，KOD FX酶（1.0 U/μL）0.8μL，dNTP（2 mmol/L）3μL，模板1μL，ddH2O 9.2μL；反应程序为:95℃预变性1 min，95℃10 s、62℃15 s、68℃20 s，25个循环，68℃3 min。再将扩增产物与CRISPR/Cas9-MT表达载体用Bsa I酶、T4DNA ligase同时进行酶切和连接，构建Cas9-q SH1-T1表达载体。（3）转化及测序验证:将连接产物经热击转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α中，37℃过夜培养后挑取单菌落扩繁培养，抽提扩繁菌液的质粒DNA用Asc I酶切鉴定，并用检测引物SP1/SP2（表1）对酶切正确的质粒DNA进行PCR扩增，扩增体系（10μL）为:上下游引物（10μmol/L）各0.25μL，2×buffer 5μL，KOD FX酶（1.0 U/μL）0.25μL，dNTP（2 mmol/L）1μL，模板1μL，ddH2O 2.25μL；程序为:95℃预变性2min，95℃10 s、60℃30 s、68℃1min，30个循环，68℃3 min，回收扩增产物送湖南擎科生物测序并将测序结果与参考序列比对验证。将经酶切和测序验证正确的Cas9-qSH1-T1表达载体转化农杆菌感受态EHA105。