《表1 本研究所使用的引物》

  提示：宽带有限、当前游客访问压缩模式

本系列图表出处文件名：随高清版一同展现

《圆斑星鲽piwil2基因的克隆与表达分析》

1. 获取 高清版本忘记账户？点击这里登录

1. 下载图表忘记账户？点击这里登录

从本实验室构建的转录组数据库中查找比对获得Vvpiwil2基因部分序列，利用Primer 5.0设计引物Vvpiwil2-S1和Vvpiwil2-A1（表1），对该cDNA序列进行验证，以圆斑星鲽成鱼性腺组织的cDNA为模板进行扩增。PCR反应体系（20μl）为：Premix Taq?（LA Taq?Version 2.0）10μl、Vvpiwil2-S1（10μmol/L）0.8μl、Vvpiwil2-A1（10μmol/L）0.8μl、cDNA（1μg/μl）1μl及ddH2O 6.4μl。PCR反应条件：94℃5 min；94℃30 s，50℃30 s，72℃1 min，35个循环；72℃10 min。扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，并在紫外线下切胶，之后，用SanPrep柱式DNA凝胶回收试剂盒、pMD18-T Vector试剂盒（TaKaRa）和DH5α进行纯化、连接与转化培养，挑取阳性单克隆，经菌落PCR鉴定后，筛选目的菌液送至华大基因进行测序，测序结果与原始Vvpiwil2基因cDNA序列进行比对，确定为Vvpiwil2基因的核心序列。之后根据Vvpiwil2基因的核心序列设计特异性引物Vvpiwil2-3?GSP-1、Vvpiwil2-3?GSP-2、Vvpiwil2-5?GSP-1及Vvpiwil2-5?GSP-2，利用巢式PCR反应获得目的片段，PCR反应体系（20μl）:Premix Taq?（LA Taq?Version 2.0）10μl、3?或5?特异性引物0.8μl、UPM 0.8μl、RACE-cDNA 1μl及ddH2O 6.4μl。PCR反应条件：94℃5 min；94℃30 s，60℃30 s，72℃1 min，35个循环；72℃10 min。将目的片段进行切胶回收、纯化、连接、转化、挑取阳性单克隆，最终将经过菌落PCR鉴定的目的菌液送到华大基因公司测序。