《表2 CRISPR/Cas9潜在脱靶位点的突变检测》

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《利用CRISPR/Cas9技术创制水稻落粒性基因qSH1突变体及突变特征分析》

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加粗字母为与sgRNA匹配的碱基；标注下划线字母为PAM区序列The base that matched the sgRNA are marked in bold；The sequences of the PAM are underlined

为检测各个靶位点的突变情况，跨靶点T1设计特异性靶点检测引物qSH1-JC-F2/qSH1-JC-R2（表1），目的片段的大小约为772 bp，T2、T3两个靶位点检测引物与T1靶点检测引物相同；跨Ta、Tb两个靶位点设计特异性靶点检测引物qSH1-JC-F1/qSH1-JC-R1（表1），目的片段的大小分别约为671bp。对T0代转基因阳性植株利用相对应的特异性靶点检测引物进行PCR扩增（反应程序及条件参照1.3中质粒DNA扩增），胶回收目的片段，送湖南擎科生物测序。利用MAGE4.0分析测序结果，在靶点位置出现与HR1128野生型序列有差异的单峰或双峰、套峰的单株即为T0代突变植株。之后将突变植株扩增的目的片段进行TA克隆，挑选10个阳性单克隆进行测序，将测序结果与HR1128野生型序列进行对比分析靶位点的突变类型及基因型。利用NCBI、Gramene的Blast工具，选择Oryza sativa Indica Group为参考序列，筛选与每个sgRNA序列匹配度大于或等于15 bp且3'端具有NGG结构的20 bp片段作为潜在脱靶位点（表2），在不同类型的T0代转基因阳性植株中对相应的潜在脱靶位点进行扩增、测序检测（脱靶位点扩增检测体系、程序与qSH1-JC-F2/R2一致），以评估各个靶位点的脱靶效应。