《表2 潜在脱靶位点鉴定引物》

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《CRISPR/Cas9介导的外源基因在猪PSP位点的定点整合》

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由于设计的sgRNA可能会与非靶点DNA序列形成错配，导致非预期的基因突变，因此用设计的sgRNA序列在CCTop在线sgRNA设计软件（http://crispr.cos.uni-heidelberg.de/index.html）中进行分析评估。根据评估结果，挑选前5个脱靶效率评分最高的位点作为潜在的脱靶效应位点（表3），设计引物通过PCR扩增这5个位点，然后将以阳性克隆细胞基因组DNA为模板的扩增产物与以未转染的PK-15细胞基因组DNA为模板的扩增产物等比例混合后测序检测。PCR反应体系参照步骤1.2.2。PCR反应条件：95℃5 min；进入循环：95℃30 s。，退火温度见表2，30 s，72℃60 s，35个循环；72℃7 min，PCR产物4℃保存。